?最后，与实验结束时相比，在注射hlf稳定过表达的h1975细胞和下调h460细胞的小鼠肿瘤组织中，进一步证实了相应的高和低表达水平补充图4f。
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?然后，采用体内左心室接种小鼠模型检测hlf对nsclc远处转移能力的影响，将载体nci-h1975、hlf过表达nci-h1975、载体nci-h460和hlfsh1nci-h460细胞接种到小鼠左心室。
?接种细胞6周后，收集小鼠的胫骨、脑、肝组织，并进行he染色处理。如图所示。图3f-i和补充图4g，我们在与载体组相比，过hlf表达小鼠组中，包括骨、大脑和肝脏等远处器官检测到较少的转移性肿瘤，以及较长的累积存活期延长。
?相比之下，沉默hlf可显著增强骨、脑和肝脏转移瘤的形成，并缩短生存期图3f-i和补充图4h。
?因此，这些结果表明，低表达hlf的nsclc细胞具有更强的局部定植和生长能力，以及更强的远处转移能力。
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?我们利用k-8、集落形成和an连接素凋亡进一步研究了hlf在nsclc中的生物学功能，发现在正常培养条件下，hlf对nsclc细胞的增殖和凋亡能力没有显著影响补充图5a–c。
?我们的结果显示，上调hlf会增加培养液的ph水平，而沉
默hlf会降低培养基的ph水平，但正常情况下hlf并不影响nsclc细胞的表型和数量补充图5d。
?低表达hlf可能通过营养代谢途径促进nsclc细胞对低营养状态的适应，因为即使在正常的含氧条件下，癌细胞也更倾向于通过厌氧途径代谢。
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?然而，上调hlf抑制nsclc的生长，而沉默hlf可促进nsclc细胞的锚定和悬浮生长能力图4a和b，表明沉默hlf增强了nsclc细胞在悬浮条件下的生存能力，即anoikis耐药。这是各种癌症中与远处转移有关的转移性癌细胞的主要特征。
?事实上，昼夜节律基因的失调导致了nsclc的代谢失调，hlf广泛参与了多种物质代谢过程，包括脂质和氧化代谢。
?在低血清1和低葡萄糖1gl培养液组成的低营养条件下，hlf过表达抑制了
nsclc细胞的增殖，但增加了凋亡潜能，反之亦然（图4c-e）。
?hlf参与了癌细胞生长培养基的营养代谢，这是hlf抑制nsclc细胞生长的前提条件。
?在低营养条件下观察nsclc细胞hlf对葡萄糖、脂肪酸和蛋白质的影响。如补充图6a，hlf表达的改变并不影响总蛋白含量。然而，hlf的上调降低了葡萄糖、甘油三酯的消耗和乳酸的分泌，但增加了游离脂肪酸的水平图4f–i。
?矛盾的是，上调hlf增加了细胞内atp的总产生和ldh的活性补充图6b和c）。这些发现表明，在低营养条件下，过表达hlf的癌细胞更容易发生有氧代谢而不是厌氧代谢，这进一步支持了上调hlf降低乳酸脱氢酶ldh的活性，厌氧糖酵解限速酶，一些厌氧糖酵解和乳酸发酵相关基因，但增强了多个三羧酸循环相关基因。
?相反，沉默hlf则表现出相反的代谢特性，促进了nsclc细胞的厌氧代谢图4f-i和补充图6c和d。上诉结果表明，低表达hlf促进非小细胞肺癌细胞的厌氧代谢。
?事实上，即使在氧含量正常的情况下，癌细胞也表现出葡萄糖代谢特征的改变，更倾向于无氧代谢，这一现象被称为“瓦伯格效应”。综上所述，我们的结果表明，低表达hlf可促进nsclc细胞从三羧酸循环向厌氧代谢的首选代谢途径的转换，从而进一步促进细胞在低营养条件下的生长。
?为了进一步确定低营养条件下hlf抑制nsclc生长和转移的潜在机制，我们将多个信号通路的荧光素酶报告质粒转染到nsclc细胞中。如图5a所示，上调hlf显著增强了nsclc细胞ppar信号活性，抑制了nf-kb信号活性相反，沉默hlf则产生相反的效果图5a。
?基于tcga的nsclc数据集中hlf的表达进行了基因集富集分析gsea，结果显示hlf的表达水平与ppar信号呈正相关，而与nf-kb信号呈负相关。根据gsea分析，hlf表达与脂质氧化和糖酵解显著相关补充图6f。
?重要的是，一些证据表明，hlf通过增加脂解诱导的游离脂肪酸积累，参与ppar的易位和激活，通过破坏p65与靶dna的结合，nf-kb信号通路广泛参与了癌症的进展和转移。ppar信号通路由pparα、pparβδ和pparγ等几个家族成员组成。因此，确定参与hlf抑制nf-kb信号通路以及nsclc肿瘤发生和转移的特异性ppar成员至关重要。
?首先，检测10对nsclc组织中pparα、pparβδ和pparγ的表达水平。如补充图6g和h，pparα在410对组织中表达显著下调，pparγ在810对表达，而pparβδ在810对组织中表达上调。已有广泛报道称pparα和pparγ在nsclc中起肿瘤抑制信号的作用，而据报道pparβδ对起致癌作用。
?esternblot分析一致显示，hlf的上调增加了pparα和pparγ的总表达和核易位，增加了ikbα的表达，但降低了磷酸化的nf-kb和p65的总水平和核水平。相反，沉默hlf则发挥了相反的作用。因此，我们的研究结果表明，hlf在nsclc中激活pparα和pparγ，抑制nf-kbp65信号通路。
?我们使用pparα激动剂非诺贝特、ppa
rγ激动剂吡格列酮和nf-kb信号抑制剂ly24091，进一步研究了pparαpparγnf-kbp65信号轴在hlf在nsclc细胞中的功能作用中的意义。
?我们的结果显示，在hlf沉默的细胞中，非诺贝特和吡格列酮显著上调了ppar的活性，而ly24091则没有上。
?然而，非诺贝特、吡格列酮和ly24091差异降低了hlf沉默细胞中nf-kb信号的活性。
?重要的是，非诺贝特、吡格列酮和ly24091减弱了hlf下调对细胞非锚定生长和抗缺氧能力的刺激作用。相反，非诺贝特、吡格列酮和ly24091逆转了低营养条件下hlf下调对nsclc细胞的促增殖（克隆生长）和抗凋亡作用