先前叶向高患病，内阁中却无人可用，于是叶向高在家中草拟奏章诏书达一月之久，后来叶向高卧床的时间更长，却仍像先前一样在家中拟旨。有人认为这不成体统，叶向高也自觉不妥，坚决乞求辞职，神宗却仍不任命其他人为宰相，而是派遣鸿胪官去安慰挽留他。等到皇帝过万寿节时，叶向高病愈，才出来理事。
此后，叶向高主持癸丑年的会试，官员的奏章都被送到考场上，成了一大奇事，皇帝考核选拔了科道官员七十多人，任命长时间不下达。叶向高几十次上疏恳切请求，结果过了两年任命才下达，言官增多之后，攻击也就纷纷出现。神宗心里很讨厌这样，就把奏章全都扣留而不下发。叶向高请求把他们交给有关部门，确定他们的去留，于是说：“大臣是小臣的纲领。当今六卿只有赵焕一人，而都御史十年没有补充新人，没有人来弹劾监督，人心怎么能安定呢？”皇帝只是责备言官胡说，而大官却一直不去补充，叶向高请求增加阁臣，奏章达一百多份。皇帝这才任用了方从哲、吴道南，叶向高上疏称谢，于是请求辞职，神宗下诏嘉奖叶向高却不同意他辞职。
皇太后驾崩，福王回到封国，叶向高乞求辞职更加频繁，奏章写了十几道，到了八月，神宗准许他辞职。叶向高入阁期间，因为三年的考绩优异，被提升为太子太保、文渊阁大学士，记录延绥的战功，加封少保兼太子太保，改任户部尚书，晋武英殿大学士；一品官三年期满，加封少傅兼太子太傅，改任吏部尚书，晋建极殿大学士。至此，神宗下令加封少师兼太子太师，赏赐白金百两，彩帛四件，表里大红坐蟒一件，派遣行人护送他回乡。
叶向高任内阁首辅期间，务求调剂各大臣的感情，安抚不同的意见，然而当时党论已十分兴盛，御史郑继芳极力攻击给事中王元翰，拥护他们二人的人分成两派互相争斗。叶向高请求将他们的奏疏下发，下诏令部院评定是非曲直，处罚议论颠倒的一、二人，来警告其他人，皇帝却不理睬。各大臣看到这样做并没有什么害处，就更加拉帮结派相互攻击。
不久，又争论李三才事件，于是形成了帮派的势力，无锡顾宪成在家闲居，在东林书院讲学，朝臣羡慕他，争相跟他交游。李三才被攻击，顾宪成写信给叶向高和尚书孙丕扬，辩白李三才的贤能。正逢京官考察，攻击李三才的刘国缙因为其它过错登记在考核的名册上，乔应甲也因为年例被派往外地，他们的同党大哗。叶向高从大局出发，秉公处理此事，考核官吏的大典才不受扰乱。但两派之间的争斗却愈演愈烈，到后来，齐、楚、浙三大派系不遗余力地攻击东林党。等到了王绍徽等撰写所谓《东林点将录》，让魏忠贤按姓名驱逐朝臣，因为叶向高曾保护东林党人，被点名为东林党党魁。
叶向高离职六年后，光宗即位，特别下诏要召回他。不久，熹宗即位，又下诏催促他回京，叶向高多次推辞，都没有获准。，叶向高回到朝廷，授中极殿大学士，再次成为内阁首辅，他说：“我服务陛下的祖父八年，当时奏章都由我草拟。即使是陛下想实行它，也要派遣中使向我宣布。如有不同意的事情，我都极力争取，您的祖父也多半能听从，不会强行拟任何旨意。陛下您虚怀若谷，谦逊有礼，信任辅臣，但不免会因流言生出难以决定的争论。应当慎重地对待诏书，所有的事情都要命令我等草拟上报。”熹宗高兴地答应了，不久皇帝采纳叶向高的请求，发放帑银二百万两，作为东西战事的急需。
熹宗执政之初，满朝廷臣都是贤能英才，百姓都高兴地希望国家得到治理，然而皇帝本来就很年轻，不能够辨别忠臣和奸臣。魏忠贤、客氏逐渐窃取了国家大权，阴谋杀害太监王安，有逐步赶走了吏部尚书周嘉谟和言官倪思辉等人。大学士刘一燝也极力请求离职，叶向高说：“客氏出宫又进宫，而顾命大臣刘一燝还赶不上一个保姆，致使大臣们想要揣摩圣意却陷入茫然之中，这样的倾向应当防止。”魏忠贤看到叶向高的奏疏指责自己，十分怀恨叶向高。不久，刑部尚书王纪被剥夺官籍，礼部尚书孙慎行、都御史邹元标先后被攻击离职，叶向高争论没有结果，于是请求跟邹元标一起被罢免，熹宗没有接受，魏忠贤由此更加怀恨叶向高了。
叶向高再任首辅，事奉未成年的皇帝，不能像明神宗时忠诚直谏，但还是有多次纠正，给事中章允儒请求减少上供的袍服，太监激皇帝发怒，命令廷杖章允儒。叶向高两次上疏营救，于是只剥夺了章允儒俸禄一年，御史帅众指责宫廷事务，太监请求皇帝把这个人派往外地，因为叶向高的营救而得以幸免。给事中傅魁营救王纪，熹宗要把他贬职流放，也因为叶向高替他说话，只是剥夺了他的俸禄。王纪被罢免后，御史吴牲、王祚昌举荐他，部议用原官职召回他，魏忠贤很不高兴，准备重罚文选郎，叶向高也进行营救，使他得以幸免。
给事中陈良训上疏指责有权势的太监，魏忠贤摘取奏疏中“国家命运将要终结”的话，命令将他下狱，穷追教唆之人，叶向高以辞职相争，于是只剥夺陈良训的俸禄而已。熊廷弼、王化贞被判处死刑，言官劝皇帝尽快处决他们，叶向高请求等司法部门复核之后再决定，皇帝同意了。有人请求将全国各省、府、州、县的仓库储蓄全都搜刮运到京师，叶向高说：“省城的库藏都已穷尽了，藩库里还稍有富余。倘若全都搜刮尽了，突然出现象山东白莲教叛乱一类的事变，拿什么去对付呢？”熹宗不听。
当时，朝臣跟魏忠贤对抗的都依靠叶向高，魏忠贤于是故意拿一些小事来责难叶向高，使他为难，为此，叶向高多次要求辞职。给事中傅魁弹劾左光斗、魏大中勾结汪文言，利用职权接受贿赂，熹宗下诏命令将汪文言下狱。叶向高说：“汪文言在内阁办事，实际是我提名的。左光斗等人勾结汪文言的事情不明不白，我任用汪文言却是清楚的。乞求陛下只处罚我一人，而宽免其他人，来消除官员们的灾祸。”于是，叶向高极力要求尽快罢免自己，在当时，魏忠贤想独揽大权，害怕那些在朝的正人君子，等候时机下手。得到傅魁的奏疏十分高兴，想借此罗织东林党人的罪名，最终因忌惮叶向高等旧臣，连同左光斗等人都没有定罪，只处罚了汪文言一人，然而此事也成了东林党狱的导火索。
杨涟上疏弹劾魏忠贤的二十四条大罪，叶向高认为事情到了决裂的份上，是极不应该的。廷臣先后上疏数十次，有人劝叶向高颁布这事，可以击败魏忠贤。叶向高考虑到魏忠贤无法轻易除掉，阁臣从中斡旋，还有希望不至酿成大祸，于是上疏称颂魏忠贤勤劳，朝廷太宠爱他，盛名之下难免招致非议，应该解除他的权力，让他回老家，保全他的始终。魏忠贤看后很不高兴，假传圣旨为自己表功，累计一百多字，叶向高吃惊地说：“这不是太监所能够干的，一定是有人代替他起草的。”侦察后得知，此人就是徐大化。
魏忠贤虽然气愤，但因为外廷势力还很强大，并不敢加害叶向高，他的党徒中有人劝导他制造大案，魏忠贤这才下定决心。在这之后，工部郎中万燝因弹劾魏忠贤而遭受廷杖刑罚，叶向高极力营救无效，万燝死于棍下。不久，御史林汝翥也因为冒犯太监而遭廷杖，林汝翥很害怕，投奔到遵化巡抚驻所。有人说林汝翥是叶向高的外甥，众太监包围叶向高的住宅大声喧闹，叶向高认为自己对国家的时事已无能为力，乞求离职已达二十多次，到这时请求离职更加坚决。熹宗于是下诏加封叶向高为太傅，派行人护送他返乡，赏赐给他的财物比按常法赐予的还要多，不久又听任他辞去太傅，每月赐给他五石米，八个轿夫。
叶向高被罢免后，韩爌、朱国祯相继成为首辅，没多久都被罢免，谄媚小人占据要职，清高的士大夫们无所倚靠。魏忠贤首先诬陷杀死了杨涟，然后是左光斗等人受辱被杀，魏忠贤贬除朝中异己，正直臣子为之一空，明熹宗驾崩，叶向高也在当月去世，终年六十九岁。