史载他“或躬督战，或遣婢将”，每年“数出师捣巢”，多次“多所斩获，寇大震”。规模最大时，马芳亲率大军奔袭四百里，捣毁内蒙古兴和地区的蒙古部落后，竟在当地旧堡垒遗址上“登高四望，耀兵而还”。马芳率主力出击内蒙北沙滩，意图重创阿勒坦主力，但阿勒坦却巧妙绕开马芳兵锋，奇袭马芳辖区宣府，攻破重镇隆庆，事后马芳因“坐寇入”之罪遭朝廷严斥，被夺去左都督职务，念及往昔战功被令“戴罪立功”。
自马芳担任宣府总兵后，阿勒坦的侵扰重点，就逐渐转向延绥、宁夏、甘肃等地区。受马芳影响，延绥总兵赵苛，大同总兵姜应熊等边将也屡次主动出击，对蒙古部落发动反攻，虽然有胜有败，但忌惮明军反扑的阿勒坦终不敢如往昔那般长驱直入，再加上蒙古部落连续数年频遭雪灾，导致阿勒坦数次南侵皆损失惨重，渐渐陷入颓势。
为扭转局面，阿勒坦集结十万骑兵，以其长子辛爱统帅，发动了对明朝边境重镇万全右卫的大规模攻击，马芳也因此迎来了他一生中最凶险一战——“马莲堡会战”。
万全右卫是明朝宣府西路长城的要冲，在明蒙战争中，它既是遏制蒙古军攻势的战略要地，更数次挫败蒙古军入侵。但阿勒坦竟一次动用了十万精骑的重兵，一旦万全右卫沦陷，阿勒坦此次南侵就将无后顾之忧，不但河北地区会惨遭涂毒，京城安全也将受严重威胁。战事爆发后，明朝迅速做出反应，兵部尚书杨博急命固原、延绥、宣府、大同、蓟镇五大总兵率精锐驰援，马芳率宣府军在正面迎击蒙古军主力，蓟镇援军从侧翼夹击，大同、延绥、固原三镇精兵于山西天成、阳和地区设伏，意图聚歼蒙古军主力。
而担任正面迎击的马芳，恰是明军战略中的关键棋子，但马芳率一万精兵刚刚赶到万全右卫北面二十里的马莲堡，即与蒙古军侦骑遭遇，继而蒙古军十万主力部队火速扑来，敌众我寡下，有副将建议立刻南撤，与万全右卫守军会合后再战，马芳断然拒绝道：“今敌气势正盛，避之必覆没，唯痛击也。”当即下令全军在马莲堡设防，升起“马”字战旗，与蒙古军针锋相对。此时大同、延绥、固原三镇援军相距遥远，蓟镇援军尚在途中，万全右卫守军兵力单薄，马芳所在的马莲堡，已是彻头彻尾的“绝地”。慑于马芳的威名，蒙古军未敢立刻发起强攻，仅派小股骑兵连续试探，马芳镇定自若，坦然应对，命令部下大张旗鼓，摆出数万精兵坐镇的假象。不明虚实的蒙古军不敢近前，仅用硬弩和土铳不断轰击，双方对峙至下午。
年久失修的马莲堡城墙在蒙古军的攻击下又突然坍塌，正当马芳的部将正慌忙修缮城墙时，马芳却断然制止，相反命令全军偃旗息鼓，甚至对蒙古军的骚扰也不再还击，一时间全军摆出了“空城计”的态势。入夜后，为试探马芳虚实，蒙古军大张旗鼓摆出全面进攻的架势，甚至点起火把彻夜呐喊辱骂，一时间“野烧蚀天，嚣呼达旦”，马芳却不慌不忙，命部下堂而皇之打开马莲堡城门，自己却在军帐里安然静坐，对蒙古军的挑衅充耳不闻。虚虚实实下，蒙古军果然上当，叫嚣整夜，却不敢贸然进攻。
“空城计”终为马芳赢得了宝贵的反击时间，次日上午，马芳亲临阵前观察，判定蒙古军正准备撤退，马芳立刻下令全军追击，先命火器齐轰，然后全军出击，明军“喊杀冲突，悍勇不可挡”。猝不及防的蒙古军再次大溃，不但被马芳追杀数十里，更被赶进了明军早已设伏良久的大同，延绥两镇精兵乘机出动，一路奋勇追杀，“沿途斩首俘获甚重”，阿勒坦再次大败。此情此景，诚如战后在杨博的奏折中所言：“此役同仇敌忾，追歼逐北，其酣畅淋漓，为九边罕见也。”对马芳，杨博更赞不绝口，称其“以汉李广之智勇，首挫寇之兵锋，当为头功也。”
万全右卫之战胜利后五个月，世宗驾崩，其子穆宗朱载垕登基即位，次年改年号为“隆庆”。穆宗即位初期颇有作为，对北部边防大力整治，而马芳也复职左都督。阿勒坦连续对蓟镇、宣府、大同、固原诸重镇发动了七次侵扰，明军严防死守，皆迫使阿勒坦无功而返，受挫之下，阿勒坦依其属下献策，经仔细筹谋，命其子辛爱率五万骑兵佯攻蔚州，待马芳中计出击后，再派精锐骑兵乘虚攻击宣府，企图重演嘉靖四十二年闪击宣府的先例。但马芳并未中计，当蒙古军奔袭至宣府后，不但见宣府重镇已经严阵以待，马芳更砍伐周边树木在城墙周边环列成栅栏，组成一道遏制蒙古骑兵突击的防线。阿勒坦见状，只得率军北撤。马芳却仍率军尾随追杀二百里，终于在长水海大破阿勒坦主力。
阿勒坦在马芳回师后，立刻集结重兵，再次发动进攻。阿勒坦兵锋逼近时，马芳尚在吃饭，闻讯后马芳当即“掷碗碟于地”，对众将大呼“且随我夺虏食”，立刻率兵出战，在内蒙古鞍子山与阿勒坦军相逢，再次击破阿勒坦，迫使其撤还。战后，马芳命人烹制美食，与此战中阵亡将士的尸骨一起下葬，时任宣大总督的陈其学闻之感叹道：“爱兵如此，方有虎师也。”
宣府遇挫后，阿勒坦转而对邻近宣府的大同地区发动进攻。而宣大总督陈其学判断失误，命大同总兵赵苛将重兵屯守在紫荆关，虽一度击退敌军，却反被阿勒坦避实击虚，绕开紫荆关攻入怀仁、山阴等地区。陈其学在盛怒之下，命时任宣府总兵的马芳与大同总兵赵苛换防，让马芳率军防备阿勒坦，而阿勒坦却转而强攻宣府管辖的威远地区，待到马芳率军驰援时，阿勒坦又率军北撤。
面对阿勒坦的侵扰，马芳决定主动出击，如他对诸将所言“非大创之不可”，马芳探知阿勒坦将主力屯于咸宁海子，随即集中全部主力出击，战前马芳严令三军，全军弃掉辎重物资，每人仅带三日口粮，以示死战之心，全军开拔，一路上“人噤声，马衔枚”，悄无声息高速急行军，抵达咸宁海子外围时，阿勒坦竟毫无察觉。凌晨马芳发动总攻，先以火器攻击，马芳的“家兵”从阿勒坦大营两翼奇袭，马芳率主力正面突击，另有一支精骑在阿勒坦逃路上截杀，阿勒坦再次中计，马芳军四面合围，驰突奔杀，阿勒坦军仓皇弃营，踩踏砍杀殒命者甚重。经一夜血战，阿勒坦终于不支而逃，明军紧紧追赶，从咸宁海子一路向西追杀数十里。
此战阿勒坦伤亡甚重，仅被擒的部落首领就有十数人，缴获战马辎重无数，史称“大创之”。刚刚就任宣大总督的王崇古阅罢战报后当场大喜道：“大同可暂无事也。”
因阿勒坦强娶其孙把汉纳吉的未婚妻乌纳楚，把汉纳吉一怒之下竟带部下家人数十人至大同投奔明朝，阿勒坦闻讯后震怒，立刻率领十余万骑兵杀至大同外围，企图用武力逼迫明朝交出把汉纳吉。但因马芳严防死守，阿勒坦丝毫未占到便宜，而王崇古深谋远虑，一面妥善安置把汉纳吉，一面向明朝提议趁机招抚阿勒坦。当时主政的高拱、张居正两位大学士皆对此全力支持，偏巧此时阿勒坦的长子辛爱虽假意发兵协助阿勒坦，其实却按兵不动，企图借阿勒坦与明朝血拼的机会谋夺权力。
在马芳小挫阿勒坦后，王崇古派百户鲍崇德为使与阿勒坦会谈，经一番辩论，阿勒坦终于屈服道“天子若封我为王，统辖北方诸部，我当约令称臣，永不复叛。”得到阿勒坦承诺后，双方达成协议：阿勒坦向明朝交还之前叛逃至蒙古的赵全等人，明朝册封把汉纳吉为指挥使，礼送回阿勒坦处。
阿勒坦逮捕赵全、李自馨、王廷辅、赵龙、张彦文、刘天麟、马西川、吕西川、吕小老至明朝，明朝也如约将把汉纳吉礼送归蒙古，为防阿勒坦报复，明朝使臣更警告阿勒坦“汝孙今为朝廷命官，不可轻辱也。”是日阿勒坦与把汉纳吉祖孙俩“相抱而哭，连连南向叩头。”阿勒坦更对明朝“遣使报谢，誓不犯大同”，交换人员后，阿勒坦主动示好，下令昆都力，吉能等蒙古部落停止对明朝边境的侵扰，王崇古也向明朝廷上奏，建议明朝“以先朝忠顺王故事”册封阿勒坦，“许贡入京”，且在边境上开放互市，从而实现明蒙双方的长期和平。虽有朝臣指责王崇古“邀近功，忽远虑”，但因大学士高拱、张居正等人支持，明朝终于下诏册封阿勒坦为“顺义王”，其兄弟子侄部下皆受封都督、同知、千户等官职，在延绥，红山敦，宁夏清水营等地开设“互市”，恢复汉蒙两族边民贸易。
阿勒坦在大同北面的晾马台正式举行“顺义王受封宣誓”的仪式，歃血盟誓道“世世代代，永不复叛”。此誓果然成真，之后不但蒙古其他部落有样学样，以至“河套各部皆求归附”，且“边鄙又安，蓟宣以抵甘固，六十余年边民生息，遂长不识兵革也。”此事结束了明蒙双方的大规模战争，达成了著名的“隆庆和议”。
“隆庆和议”成功后，马芳作为大同总兵，在每年五月，都受命率精兵护送王崇古到大同北面的弘赐堡接见蒙古各部首领，宣扬明朝威德，每次马芳部皆“兵甲威武，诸部皆拜服之”。
在神宗即位后的政治斗争中，原内阁首辅高拱失势被逐，大学士张居正取而代之，随后身为高拱亲信的王崇古，被御史陈堂弹劾“弛防徇敌”，不得不引咎辞职，马芳随后也未能幸免。他担心不能通过阅视，于是贿赂武库司郎中林绍、怀隆及兵备参议吴哲、阅视侍郎吴百朋，吴百朋告发此事，奏请朝廷提审马芳。经兵部尚书杨博说情，神宗革去马芳的职务，勒令他“归家闲住”。
阿勒坦向朝廷索要封赏，并威胁要兵戎相见，朝廷立刻命马芳挂印，充任宣府总兵官。马芳到任后，整治兵马，在宣府郊外率领骑兵举行了数次“游猎”，蒙古各部闻讯后大惊道：“马太师归也。”阿勒坦急忙向朝廷“奉表谢罪，痛悔前过。”原本一触即发的兵祸就此消解。马芳因病请辞，解甲归乡，在家乡蔚州逝世，享年六十四岁，神宗闻讯后，按例赐祭葬。