武宗逝世后，朱厚熜顺利继位，史称明世宗。因为定策有功，世宗非常感激，赐封毛纪为伯爵，毛纪坚决辞谢，奉劝世宗收回了成命，毛纪的高风亮节，深受百官赏识。
嘉靖初年，朝中张璁等一批年轻官员，拥护世宗尊崇生身父亲为皇考，毛纪与杨廷和、蒋冕、毛澄等人坚决反对。于是，朝廷暴发一场“大礼仪”之争。这场争辩，历时几春秋，造成一百三十四人入狱坐牢，廷杖打死十余人，毛澄辞职回乡，杨廷和、蒋冕相继被免职丢官，在这种形势下，毛纪顶风当宰相。
毛纪接任首辅后，仍然坚持原来的观点，千方百计营救因谏争而下狱的官员，世宗亲自出马做工作，三番五次地劝喻毛纪，毛纪总是不改初衷。这天，世宗在平台召见毛纪，要求毛纪让他给生父以最崇高的地位，毛纪依然摇摇头，他说：“陛下要这样做，先帝的位子怎么放呢？”明世宗发怒了，指责毛纪固执己见，“要结朋奸，背君报私。”毛纪回答说：“司马光曾经告诉神宗说，陛下之所以用臣，是因为看重了臣狂直敢言，有益于国家。如果为了自己的地位荣誉而不敢直言，那才是以官谋私。臣今天也是这样。要结朋奸，背君报私，这正是臣平日最痛恨的。既然陛下这样怀疑臣，臣乞求离职归乡，希望陛下任贤纳谏，审是非，识忠奸，明正邪，以养太平之福。”
世宗听了，既恨毛纪固执，又感毛纪正直，无可奈何，考虑再三，世宗恩准毛纪辞职回乡，同时诏令官府配给随从和粮食。这样，毛纪当宰相的时间只有三个月，这三个月的宰相，毛纪当得不容易啊，他是提着脑袋当宰相的，留下了刚直不阿的美名。
毛纪致仕后，安享田园之乐，游息之余编著了许多书。如《密勿稿》、《辞荣录》、《海庙集》、《联句私钞》、《归田杂识》、《鳌峰类稿》等。毛纪80岁大寿，世宗亲派大臣慰问，毛纪逝世，享年八十三岁，世宗赠赐他为太保，谥号文简。毛纪的儿子毛渠，进士，官居太仆卿。